拉曼光譜儀或熒光顯微鏡中激光光斑尺寸的影響因素分析-儀器儀表網(wǎng)

　　【儀器儀表網(wǎng) 專題推薦】在顯微拉曼光譜儀或熒光顯微鏡中，激光的光斑尺寸大小是一個重要參數(shù)，它取決于激光的波長和顯微鏡的物鏡的特性。

　　艾里斑

　　當(dāng)光穿過任何孔徑(例如顯微鏡物鏡)時，就會發(fā)生衍射。由均勻照射圓形光圈所產(chǎn)生的衍射圖稱為艾里斑圖(Airy pattern)，如圖1所示。它由一個明亮的中心圓(稱為艾里斑)組成，包含總光強的84%，其余的16% 分布在一系列逐漸減弱的同心環(huán)上。

　　圖1. 激光光斑的艾里斑模擬圖和光斑尺寸的不同定義。

　　艾里斑的直徑(定義為衍射圖樣中zui小圓斑的直徑)通常是顯微鏡中“光斑大小”的意思。其直徑大小取決于激光的波長和物鏡的數(shù)值孔徑(NA)：

　　顯微鏡的橫向空間分辨率極限與等式1密切相關(guān)，通過將系數(shù)1.22替換0.61即可。

　　艾里斑直徑不是光斑尺寸的weiyi定義。另外兩個常見的定義是衍射圖樣中光斑在半峰寬(FWHM)或1 / e2峰寬時的大小，由下式：

　　艾里圓斑是在假定沒有像差的完美光學(xué)系統(tǒng)下代表可以達(dá)到的zui小光斑尺寸，在實際中很難達(dá)到。激光的光束直徑通常比物鏡的后孔徑窄，并且沒有均勻的橫向強度(通常具有高斯分布)，并且用激光直接照射物鏡會導(dǎo)致光斑尺寸大于等式1所預(yù)測的。

　　解決的辦法是擴(kuò)大激光束，使其光束直徑大于目標(biāo)物的后孔徑，達(dá)到近似均勻的照明，這就是所謂的過度填充。過度填充的程度越大，就越接近均勻照明，光斑的大小也越接近公式1。過度填充是以降低到達(dá)樣品的激光強度為代價的，并且是在空間分辨率和通過物鏡傳輸?shù)墓β书g做選擇。

　　激光波長的影響

　　光斑大小取決于激光波長(公式1)，較短的波長激光器提供較小的光斑和更高的空間分辨率。使用高倍的物鏡(100x 0.9 NA)，可以在三種常見的波長下獲得光斑大小如圖2所示。

　　圖2. 在100x0.9NA物鏡下不同波長的光源對應(yīng)的光斑大小模擬圖。

　　物鏡的NA值影響

　　光斑的大小還取決于物鏡的數(shù)值孔徑(NA)，該數(shù)值孔徑測量的是光線進(jìn)入或離開透鏡的傾斜度，

　　其中n是物鏡和樣品之間介質(zhì)的折射率，α是進(jìn)入/出射物鏡的光錐的半角。

　　NA取決于物鏡的構(gòu)造，并且通常隨物鏡放大倍數(shù)的增加而增加。標(biāo)準(zhǔn)空氣(n = 1)物鏡的NA極限值<1，由于浸油物鏡的折射率較高，因此可以將NA提高到約1.4。NA越高，物鏡的收光角越大，可以實現(xiàn)的光斑尺寸越小，這在圖3中用三個常用的空氣物鏡進(jìn)行了說明。

　　圖3.模擬在物鏡的數(shù)值孔徑不同情況下532nm激光光斑大小。

　　需要注意的是，圖3在某種程度上進(jìn)行了簡化，因為模擬假設(shè)所有三個物鏡的后孔徑均被均勻照明。如上所述，這是通過光束擴(kuò)展和過度填充物鏡的后孔來實現(xiàn)的。但是，后孔徑的直徑隨物鏡放大倍數(shù)而變化，即后孔徑的直徑隨放大倍率的增加而減小。在多物鏡系統(tǒng)中，光束擴(kuò)展通常是針對高放大倍率物鏡進(jìn)行優(yōu)化的，而具有較大后孔徑的低放大倍率物鏡(例如，圖3中的20X0.4NA)通常不會被過度填充，并且激光的光斑尺寸和衍射圖將會有更多的高斯特性。