【儀器儀表網(wǎng) 專題推薦】現(xiàn)在，我們來(lái)介紹蛋白質(zhì)染料間接測(cè)量中的另外兩種測(cè)定方法，雙縮脲法和BCA法。

雙縮脲檢測(cè)法

雙縮脲檢測(cè)法通常用于確定生物樣品中的總蛋白質(zhì)。該測(cè)定法可定量濃度范圍為0.5至約10mg/mL的蛋白質(zhì)。干擾物質(zhì)為銨鹽、三羥甲基氨基甲烷緩沖液和能增強(qiáng)顏色的還原劑二硫蘇糖醇。在zui大540 nm下的吸光度測(cè)量樣品以確定數(shù)量。

原理：

雙縮脲試劑是一個(gè)堿性的含銅試液，呈藍(lán)色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配制。當(dāng)?shù)孜镏泻须逆I時(shí)(多肽)，帶兩個(gè)以上肽鍵的肽在含有酒石酸鉀鈉的堿性介質(zhì)中與銅離子形成紫色螯合物。紫色顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。

儀器及配件：

? UV7分光光度計(jì)(ME-30254726)

? CuvetteChanger自動(dòng)多聯(lián)池 (ME- 30236313)

? Rainin移液器

100 - 1000μL (ME-17011782)

10 - 100μL (ME-17011781)

500 - 5mL (ME-17011790)

? 10 mL 玻璃試管

? 一次性1cm光程比色皿

試劑：

? 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(50 mg / mL)

? 雙縮脲試劑

? 蛋白質(zhì)樣品1和2

結(jié)果：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

540nm處的吸光度與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

通過(guò)上面的結(jié)果可以看到，在UV7分光光度計(jì)上進(jìn)行雙縮脲測(cè)定時(shí)，在10mg/200 μL以下時(shí)，BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)R2為0.999，測(cè)試的兩個(gè)蛋白質(zhì)樣品的Srel分別為0.32 %和 0.33 %，這說(shuō)明測(cè)量值有較好重復(fù)性;回收率分別高達(dá)為100.8%和97.6 %。

二喹啉甲酸(BCA)檢測(cè)法

二喹啉甲酸(BCA)檢測(cè)法用于生物樣品中總蛋白濃度的比色檢測(cè)和定量，是Lowry測(cè)定法的一種改進(jìn)方法。BCA蛋白測(cè)定法適用于含有zui高5%去污劑(表面活性劑)的樣品。此外，該蛋白質(zhì)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，相對(duì)穩(wěn)定的有色絡(luò)合物，可調(diào)節(jié)溫度實(shí)現(xiàn)不同的靈敏度。

原理：

反應(yīng)的di一步，在堿性溶液中通過(guò)肽鍵將Cu2+離子還原為Cu+離子。被還原的Cu2+量與溶液中存在的蛋白質(zhì)量成正比。其次，兩個(gè)帶有一個(gè)亞銅陽(yáng)離子(Cu+)與BCA分子形成螯合，因此顏色變成了紫色，并在562 nm處進(jìn)行測(cè)量，紫色顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。

儀器和配件：

? UV7分光光度計(jì)(ME-30254726/30254729)

? CuvetteChanger自動(dòng)多聯(lián)池 (ME-30236313)

? Rainin移液器

100 - 1000 μL (ME-17011782)

500 - 5 mL (ME-17011790)

? 10 mL 玻璃試管

? 一次性1cm光程比色皿

試劑：

? 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品BSA(2 mg / mL)

? BCA試劑A

? BCA試劑B

結(jié)果：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

562nm處的吸光度與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

通過(guò)上面的結(jié)果可以看到，在UV7分光光度計(jì)上進(jìn)行BCA法測(cè)量時(shí)，在250 μg/mL以下時(shí)，BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)R2為0.999，Srel為0.289%，表明測(cè)量結(jié)果有較好重復(fù)性;回收率高達(dá)97.8%。